Sierodiagnosi dell'epatite

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Per determinare il virus dell'epatite, per ottenere informazioni sull'origine della malattia, le condizioni e le cause dell'incidente, si esegue la sierodiagnosi dell'epatite C, b, a. L'identificazione dei marcatori sierologici consente di formulare una diagnosi e prendere il giusto trattamento. I marcatori includono proteine ​​virali, anticorpi specifici, che il corpo produce come risposta all'infezione e agli acidi nucleici del virus.

Cos'è?

Serodiagnosi: riconoscimento dell'eziologia delle malattie rilevando gli anticorpi nel sangue. I marcatori sierologici sono diagnostici tardivi, poiché le reazioni sono possibili per 10-12 giorni dall'inizio della malattia. Gli studi di serodiagnostica sono condotti per:

  • diagnosticare la malattia - per determinare la presenza di anticorpi nel sangue, utilizzando antigeni standard;
  • identificare il patogeno - per identificare antigeni sconosciuti.

Per la sierodiagnosi utilizzare: cellule batteriche; plasmacellule e linfociti, tumore e cellule malate; ingredienti solubili. Ci sono 6 gruppi di reazioni sierologiche:

  1. Reazioni che si verificano con l'allargamento delle particelle di Ag.
  2. Reazioni di legame complementare e emolisi immunitaria.
  3. Reazione di immunofluorescenza
  4. Reazioni anti neutralizzazione
  5. Reazione con fagocitosi.
  6. Reazioni di analisi immunosorbente con antigeni e anticorpi.
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Cosa mostra l'analisi?

Condurre diagnosi sierodiagnosi ai pazienti, se per qualche motivo non è possibile diagnosticare, escludendo la malattia. L'analisi identifica il tipo di agente patogeno e aiuta a fare una diagnosi. Inoltre, la sierodiagnosi consente di scegliere la migliore opzione di trattamento. Sintomi da testare: attacchi irragionevoli di debolezza, scarso appetito, nausea, scolorimento delle feci e delle urine, pelle gialla. La sierodiagnosi tempestiva conferma o nega l'infezione e determina lo stadio della malattia.

Caratteristiche di sierodiagnosi e tipo di epatite

La shell di ogni virus ha il proprio set di proteine. E gli amminoacidi che costituiscono la proteina sono considerati una specie di set di codici. Questo codice è un marker per la sierodiagnosi. I marcatori dell'epatite A sono IgM e IgG anti-HAV. Marcatori di epatite B - HBcAg, HBsAg, HBeAg. I marcatori del virus C - HBCAg. Per la sierodiagnosi del virus A vengono utilizzati: IEM (microscopia immunoelettronica), CSC (legame del complemento), RIA (uso di Anti e Ag etichettati), REMA (reazione enzimatica anticorpale). La sierodiagnosi per virus B utilizza RIA, REMA, RPG (precipitazione in gel) e RIGA (emoagglutinazione indiretta). RIGA usa gli eritrociti caricati con HBsAg. Per la sierodiagnosi dell'epatite C è stato utilizzato il dosaggio immunoenzimatico.

Marcatori dell'epatite A

Lo studio sull'epatite A è finalizzato alla determinazione di IgM e IgG. Questi indicatori appaiono nel sangue non appena aumenta il livello degli enzimi sierici nel corpo. IgM anti-HAV - è un indicatore del livello di anticorpi M del virus dell'epatite. Dopo l'infezione, l'indicatore aumenta e fino a quando compaiono i primi sintomi, un esame del sangue mostrerà un risultato positivo. IgG anti-HAV: questa classe viene determinata 10 settimane dopo l'infezione nel corpo. L'indicatore rimane il più spesso alto dopo il recupero, indica che il processo di formazione di immunità al virus di tipo A ha inizio.

Con l'aiuto del marcatore HBsAg, l'epatite B può essere rilevata in una fase precoce, l'antigene si manifesta a 27-41 giorni dopo l'infezione nel corpo.

Marcatori dell'epatite B

Lo studio si propone di identificare antigeni e anticorpi. La serodiagnosi consente di formulare una diagnosi e predire l'esito della malattia. Per ogni fase viene rilevato un diverso marker HBV. Durante il periodo di incubazione, l'antigene viene conservato nel sangue per 2-5 mesi. Un indicatore di infezione è la determinazione simultanea di HB e HB. All'inizio del recupero, HBc e HBe scompaiono dal sangue, si forma l'anti-HBc, successivamente vengono rilevati anticorpi contro tutti i tipi di antigene nel sangue. La presenza di HbsAg indica un'infezione, se l'antigene è nel sangue per più di sei mesi, quindi la malattia è in uno stadio cronico. Anti-HbsAg - mostra che gli anticorpi si sono formati nel corpo e il sistema immunitario combatte attivamente contro il virus. HbsAg viene rilevato un po 'di tempo dopo il recupero. Anti-HbcAg viene rilevato con i sintomi e continua per tutto il periodo.

Negli studi di laboratorio vengono rilevate due classi di anticorpi: IgM - viene sintetizzato nelle fasi iniziali ed è un segno di recente infezione o alta attività del virus. IgG - formata 2-3 mesi dopo l'infezione, fornisce l'immunità. L'indicatore HbeAg indica l'attività di infezione. I pazienti che hanno antigeni nel sangue sono pericolosi per trasmettere il virus, quindi bisogna fare attenzione. Quando viene rilevato Anti-HbeAg, l'immunità inizia a formarsi.

Marcatori dell'epatite C.

Il virus dell'epatite C si replica in modo inattivo, quindi ci sono difficoltà nella diagnosi di infezione. L'unico modo per rilevare il virus C è rilevare l'RNA. La sua determinazione viene effettuata mediante saggio immunoenzimatico, che identifica la quantità di anti-HCV. Gli anticorpi vengono rilevati 4-6 settimane dopo che il virus entra nel sangue. Durante questo periodo inizia la formazione e la circolazione delle IgM. Dopo 3 mesi, inizia la sintesi di IgG. La rilevazione a lungo termine di IgM indica l'attività del virus e lo stadio cronico della malattia. Nella forma cronica, la rilevazione di IgM indica danni al fegato. Il risultato di un saggio immunoenzimatico non è una base per la diagnosi, il metodo è utilizzato come test di screening per identificare la forma cronica. Avendo trovato anticorpi contro l'HCV e per sospetta epatite C, è necessario sottoporsi ad un esame di laboratorio completo.

Un test immunoenzimatico per la sierodiagnosi può rilevare anticorpi contro l'epatite C nel 95% dei casi della forma cronica, nella forma acuta l'accuratezza del metodo è del 50-70%.

La diagnosi di serodiagnosi non ha specificità e sensibilità del 100% nella diagnosi di epatite virale. Pertanto, quando si valutano i risultati, è necessario tenere conto dei sintomi e utilizzare diversi test per diagnosticare il risultato. Nel valutare i risultati degli studi sierologici, dovrebbero essere presi in considerazione la storia della malattia, le informazioni sulle malattie passate e le vaccinazioni, nonché il possibile contatto con la fonte dell'infezione.

Diagnosi sierologica dell'epatite virale

La diagnosi inizia con l'esame del paziente. Per una corretta e tempestiva diagnosi di "epatite virale", i medici esaminano prima il paziente, indirizzandolo a prendere esami del sangue e delle urine.

Prima di tutto, prestano attenzione a tali sintomi caratteristici del periodo iniziale della malattia come letargia, debolezza muscolare generale, perdita di appetito, nausea, disturbi addominali, oscuramento del colore delle urine, ingrossamento e ispessimento del fegato, aumento della sensibilità al dolore del suo margine inferiore. In generale, l'analisi dei medici del sangue fa attenzione al contenuto di leucociti, linfociti, ESR.

Ricorrono ai test biochimici del sangue e delle urine per valutare il grado di danno epatico e confermare se l'ittero è associato a infiammazione del fegato. Il più significativo è il livello del pigmento biliare - la bilirubina, che si forma nel fegato a causa della scomposizione dei globuli rossi.

Normalmente, la bilirubina è legata alle proteine ​​del sangue e non ha effetti tossici sui tessuti corporei. Con l'epatite, la concentrazione di bilirubina libera e legata nel sangue aumenta nettamente. Quando supera i 200-400 mg / l, l'ittero diventa visibile all'occhio.

Il danno dell'epatocita parla di un livello crescente di attività delle transaminasi - ALAT e AST, che entrano nel sangue dalle cellule del fegato attraverso le membrane danneggiate. Ci sono anche test speciali per lo stato del sistema di coagulazione del sangue, in cui sono coinvolte le proteine ​​sintetizzate nel fegato. Una reazione positiva dell'urina all'urobilina ha un valore diagnostico.

La prova della compromissione della funzionalità epatica è un test del timolo. Un cambiamento dell'indice di protrombina caratterizza la gravità dell'epatite virale e un aumento dell'attività della fosfatasi alcalina, la bilirubina totale, indica una violazione della funzione secretoria del fegato. La reazione dell'urina ai pigmenti della bile all'inizio della malattia è molto meno positiva.

Nella diagnosi di non piccola importanza, entrambe le forme acute e croniche di epatite virale sono date all'esame ecografico degli organi della cavità addominale. Utilizzando questo metodo, i medici possono determinare tali cambiamenti che non vengono rilevati da esami esterni: ingrossamento del fegato, restringimento delle vene epatiche, indurimento e ispessimento delle pareti, segni di infiammazione della cistifellea e del pancreas, portale dilatato e vene spleniche, ingrossamento della milza, ingrossamento dei linfonodi. Il metodo diagnostico più importante, in particolare l'epatite cronica, è una biopsia epatica.

I metodi per rilevare gli anticorpi e gli antigeni nel sangue e in altri fluidi corporei includono la diagnostica sierologica. Per la diagnosi precoce dell'epatite virale, comprese le forme anterteriche e asintomatiche, la presenza di proteine ​​virali (antigeni, chiamati anche marcatori dell'epatite virale) o anticorpi ad esse mediante analisi immunoenzimatica (ELISA) è determinata nel siero. Inoltre, ELISA è completato, quando possibile, da una reazione a catena della polimerasi (PCR), che consente di determinare la presenza di acidi nucleici virali nel siero - DNA del virus dell'epatite B, virus RNA di altra epatite, che è particolarmente importante per l'inizio del trattamento tempestivo.

Il test immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) - è un metodo universale di diagnosi immunologica, ampiamente utilizzato nella pratica. È progettato per rilevare le proteine ​​virali (antigeni) o gli anticorpi prodotti dal sistema immunitario in risposta alla penetrazione di virus nel corpo umano. Queste proteine ​​sono marcatori (segni) o segni peculiari, la cui presenza consente di effettuare una diagnosi accurata, valutare la natura della malattia, aiutare il medico a scegliere il trattamento giusto. Questo metodo si basa sulla ben nota interazione antigene-anticorpo.

Per identificare gli antigeni, varie aziende commerciali producono sistemi di test che sono piastre di polistirolo da 96 pozzetti. Sul fondo dei pozzetti, gli anticorpi sono pre-adsorbiti ("suturati") a uno o un altro antigene del patogeno, ad esempio, all'antigene di superficie del virus dell'epatite B - antigene HBs.

Al primo stadio, un campione viene aggiunto a ciascun pozzetto, ad esempio il siero del sangue del paziente a diverse diluizioni, contenente proteina virale non ancora determinata (antigene). Se questa proteina (antigene) "riconosce" il suo anticorpo, allora si verifica il loro legame. Ciò significa che il siero del paziente contiene l'antigene, anticorpi ai quali sono sorbed sul fondo della piastra.

Per vedere i risultati di questa reazione, c'è lo stadio seguente, in cui un composto viene aggiunto al complesso "antigene-anticorpo" che si lega all'anticorpo. Questo composto contiene un enzima come la perossidasi di rafano. Quando viene aggiunto un substrato, quest'ultimo viene diviso, seguito dalla colorazione della soluzione in un colore giallo-marrone.

Nella fase successiva, ciascun pozzetto viene accuratamente lavato da componenti non reagiti. In quei pozzi in cui l'antigene, come nel nostro caso, è completamente legato all'anticorpo, non può più interagire con il composto aggiunto.

Pertanto, viene rimosso dal pozzo durante il lavaggio. Quando il siero viene diluito, il contenuto di anticorpi in esso contenuti diminuisce e non sono più in grado di legare completamente l'antigene. In questi pozzi, il composto contenente l'enzima si lega all'antigene e rimane nel pozzetto dopo il lavaggio. Nella fase successiva, aggiungere il substrato e vedere i risultati della reazione, che viene valutata visivamente o utilizzando uno spettrofotometro.

Pertanto, abbiamo scoperto che il campione di siero del paziente contiene l'antigene HBs. Puoi anche scoprire la quantità o il titolo, determinando l'ultima diluizione del siero, dove è apparso un colore giallo. Maggiore è il grado di diluizione, più il virus è contenuto nel sangue del paziente.

Analogamente, può essere determinata la presenza di anticorpi verso un particolare agente eziologico dell'epatite virale. Solo in questi casi vengono utilizzati sistemi di test diagnostici con "cucito" sul fondo dei pozzetti, non con anticorpi, ma con antigeni noti. I vantaggi di questo metodo sono l'alta sensibilità e specificità, la facilità di reazione, la possibilità di esaminare un gran numero di pazienti allo stesso tempo. Tra le carenze del metodo vi è la necessità di attrezzature costose speciali e qualifiche adeguate del personale.

Metodo di reazione a catena della polimerasi

Nella moderna diagnostica di laboratorio, la PCR occupa un posto speciale. Il metodo PCR ha portato la diagnosi clinica di laboratorio ad un'altezza fondamentalmente diversa - il livello di determinazione degli acidi nucleici (DNA e RNA), che consente il rilevamento diretto di un agente infettivo o di una mutazione genetica in qualsiasi mezzo biologico.

In questo metodo PCR, teoricamente, è possibile rilevare una molecola di acido nucleico desiderata tra milioni di altri. Dal punto di vista della medicina clinica, la definizione di acido nucleico è equivalente alla rilevazione del patogeno nell'oggetto di studio.

È noto dalla biologia che gli acidi nucleici (DNA o RNA) possiedono la proprietà dell'auto-riproduzione (riproduzione). Questo principio è alla base del metodo della PCR, quando questo processo viene eseguito artificialmente in laboratorio. Per questo, un acido nucleico viene prima isolato da un campione di tessuto ottenuto da un paziente (ad esempio, in caso di sospetta epatite virale).

Svolge il ruolo di una sorta di "matrice" su cui viene eseguita la sintesi. L'acido nucleico ha la sua "impronta" - una sequenza unica di nucleotidi di cui è composto. Per ogni agente patogeno, una tale sequenza è stata studiata, è stata compilata una sorta di "mappa".

L'elemento più importante nella PCR è il primer (sezioni corte del DNA complementari (corrispondenti) alle regioni dell'acido nucleico isolate dal campione). I primer forniscono l'avviamento e la specificità della reazione.

Pertanto, il sistema di test per PCR consiste in una miscela di acidi nucleici del campione del test, un primer e speciali enzimi (polimerasi) attraverso i quali questa reazione è impossibile. L'analisi della PCR prevede diversi cicli (passaggi), in conseguenza dei quali si ottengono copie esatte di una regione riconoscibile dell'acido nucleico del modello. Questi cicli sono ripetuti 30-50 volte secondo un dato programma. Il prodotto finale di questa reazione è riconosciuto dall'elettroforesi su gel.

Indicatore "Sensibilità"

Uno dei criteri più importanti per l'efficacia diagnostica di qualsiasi analisi di laboratorio è l'indicatore di "sensibilità". Dovrebbe distinguere tra sensibilità analitica e diagnostica. La sensibilità analitica, applicata alla PCR, è il numero minimo di copie di DNA o RNA in 1 ml di soluzione campione, che può essere determinata da questo sistema di test.

La maggior parte dei sistemi di test commerciali è in grado di rilevare l'acido nucleico desiderato in un campione biologico, anche se la sua concentrazione è di diverse centinaia di copie per 1 ml di campione. Questo è connesso con la situazione generale che determina l'idoneità clinica di qualsiasi metodo diagnostico di laboratorio o sistemi di test - la sensibilità diagnostica del metodo non deve essere inferiore al 95-98%.

Il secondo criterio universale di efficacia del laboratorio è la "specificità", che è determinata dalla percentuale di persone sane che hanno risultati di analisi veramente negativi. Il metodo PCR ha la massima specificità, che raggiunge il 99-100%.

La sensibilità diagnostica e la specificità della PCR sono paragonabili e spesso superano quelle fornite da altri metodi che sono il "gold standard" nella diagnosi delle malattie infettive.

I risultati dell'analisi PCR possono essere ottenuti entro un giorno lavorativo, mentre i campioni prelevati per l'analisi possono essere conservati (accumulati) per anche diverse settimane mentre si osservano le norme di temperatura appropriate. Una valutazione riassuntiva della sensibilità dei vari metodi diagnostici effettuati di recente in diversi centri di ricerca stranieri ha mostrato che l'ELISA ha una sensibilità del 50-70% e PCR - dal 90 al 100%.

La PCR, rispetto all'ELISA e ad altri metodi, presenta due importanti vantaggi: alta sensibilità e tempi di analisi brevi, ovvero la "rilevanza" di ottenere un risultato di ricerca da parte di un medico e di un paziente.

Prima di altri metodi di diagnostica clinica di laboratorio, ci sono vantaggi della PCR:

- Il metodo consente di rilevare qualsiasi DNA e RNA, anche nei casi in cui l'uso di altri metodi è impossibile da eseguire;

- il metodo ha un'elevata specificità (fino al 100%). È dovuto al fatto che nel materiale in esame si trova un unico frammento di acido nucleico che è caratteristico solo di un determinato agente patogeno o gene;

- la possibilità di condurre non solo la valutazione qualitativa (disponibilità), ma anche quantitativa (concentrazione) del contenuto di acido nucleico. Attualmente, con l'aiuto di sistemi di test commerciali, è possibile determinare diverse centinaia di copie nel campione in esame;

- l'elevata producibilità e automazione del metodo consentono al medico di ottenere i risultati dello studio e di condividere con loro il paziente il giorno dell'analisi;

- La PCR consente di identificare l'agente patogeno nel corpo prima dello sviluppo della malattia, ad esempio nel periodo di incubazione;

- per eseguire analisi PCR è sufficiente un volume minimo di campione (fino a diversi microlitri);

- L'analisi PCR consente di diagnosticare simultaneamente diversi patogeni in un campione senza pregiudizio per la sensibilità o la specificità del risultato;

- I risultati ottenuti dalla PCR possono essere inseriti in supporti informatici o fotografati per un'ulteriore valutazione da parte di esperti indipendenti.

Nonostante i suddetti vantaggi, il metodo PCR non è ancora privo di alcuni svantaggi che dovrebbero essere considerati nella valutazione dei risultati della ricerca:

- i requisiti più elevati per le attrezzature di laboratorio, la qualità dei sistemi di prova e la stretta osservanza delle normative di ricerca al fine di evitare risultati falsi. Risolvere il problema della qualità delle analisi è possibile con adeguate qualifiche del personale e certificazione obbligatoria del laboratorio;

- valutazione ambigua di un risultato positivo della PCR. È questo fatto che spesso è un argomento irragionevole per i professionisti per dubitare del risultato ottenuto e dell'efficacia del metodo PCR. Ad esempio, negli individui con il DNA del patogeno rilevato nel sangue mediante il metodo PCR, la malattia potrebbe non svilupparsi clinicamente.

In questa situazione, quando si valuta l'analisi della PCR, si dovrebbe parlare di un paziente infetto e non dello sviluppo di una malattia infettiva. Il metodo di PCR - analisi consente di determinare la presenza o l'assenza dell'agente patogeno, in gran parte risponde alla domanda "trattare non trattare", e consente anche di valutare la qualità del trattamento monitorando la presenza o l'assenza del patogeno. Il medico, valutando il risultato dell'analisi PCR, si rende conto che questo risultato non è l'unico argomento nel prendere la decisione di iniziare il trattamento o di rifiutarlo.

Sono stati sviluppati sistemi di test per ogni tipo di patogeno dell'epatite virale, ma il metodo più prezioso di PCR è stato trovato nella diagnosi di epatite B, C, D, G. Il metodo PCR è estremamente importante per la diagnosi dell'epatite B. Ciò è dovuto al fatto che ci sono mutanti (con tratti alterati), che non sono determinati da test sierologici convenzionali.

Il metodo di analisi PCR consente di identificare e quale forma è il virus dell'epatite 15, se è capace di riproduzione indipendente o integrata (integrata) nel DNA della cellula ospite. Questo è di importanza clinica critica, poiché con la forma integrativa di questa infezione, una persona non è contagiosa per gli altri (sicurezza per il partner sessuale, idoneità professionale, non vi è alcun rischio di trasmissione verticale del virus dalla madre al feto, ecc.).

Inoltre, la terapia antivirale non è indicata per tali pazienti, inoltre, è persino pericolosa. Tuttavia, con una forma integrativa di infezione, la probabilità di sviluppare un cancro al fegato aumenta drasticamente (di oltre 200 volte). Queste persone devono sottoporsi a un esame clinico, di laboratorio e strumentale completo almeno una volta all'anno.

Il metodo PCR può agire da arbitro per determinare la necessità di iniziare il trattamento e monitorarne l'efficacia. La rapida scomparsa del DNA del virus dell'epatite B dal sangue è un test diretto e affidabile dell'esito positivo del trattamento antivirale.

Pertanto, la determinazione del DNA del virus dell'epatite B nel plasma sanguigno è l'analisi più importante che, insieme ad altri test di laboratorio, consente di diagnosticare obiettivamente un'infezione, determinare la natura del processo infettivo, agire come criterio nella conduzione della terapia e valutarne l'efficacia.

Il metodo dell'analisi PCR non ha eguali nella diagnosi, nella valutazione della prognosi e nel successo della terapia antivirale dell'infezione causata dal virus dell'epatite C. L'uso della PCR consente di rilevare il virus dell'epatite C nella fase più iniziale del processo di infezione, dal momento che l'RNA del virus dell'epatite C può essere rilevato nel siero del sangue una settimana dopo l'infezione Con questo metodo, vengono determinate le varietà genetiche di questo virus, che consentono al medico di prescrivere il trattamento corretto.

Nel caso dell'epatite virale D, il metodo di analisi PCR consente la determinazione dell'RNA virale nel siero del paziente e l'infezione mista da epatite B e D. Pertanto, questo metodo di ricerca può essere utilizzato per monitorare l'efficacia del trattamento, la prognosi del decorso e l'esito della malattia. È importante che il medico determini se c'è un'infezione mista, poiché l'epatite D aumenta l'effetto necrotico nell'epatite B e, quindi, aumenta il rischio di sviluppo.

Il metodo di analisi PCR è attualmente l'unico modo per dimostrare la presenza di infezione con il virus dell'epatite C.

Considerare l'uso di metodi diagnostici per diverse epatiti.

Epatite E. Le principali caratteristiche diagnostiche del virus dell'epatite E sono: l'assunzione di un meccanismo di trasmissione dell'acqua, l'età del paziente varia da 20 a 40 anni, la prevalenza nelle regioni è prevalentemente tropicale e subtropicale, le manifestazioni cliniche sono simili all'epatite A con una predominanza di forme lievi, la registrazione di forme gravi con la minaccia di letali risultato nelle donne in gravidanza nella seconda metà della gravidanza, meno spesso nel periodo postparto precoce e nelle madri che allattano (si verificano con emolisi intensiva, emoglobinuria, rene acuta sufficienza e sindrome tromboemorragica grave). Conferma la diagnosi della rilevazione di anticorpi nel sangue.

Epatite B. L'epatite B virale è sospettata da un medico se è stata trasfusa con sangue o suoi componenti (eritrociti, leucociti, massa piastrinica) 45-180 giorni prima dell'inizio della malattia, eseguiti interventi chirurgici, studi su organi interni, iniezioni multiple (inclusi farmaci ), o, cosa che accade molto meno frequentemente, se il paziente ha avuto un contatto sessuale o stretto con un paziente affetto da epatite B. Il criterio per la conferma precoce della diagnosi è la rilevazione di antigeni HBs, HBe e HBc nel sangue e DNA virale.

Marcatori sierologici per epatite acuta B

Epatite C. Contrariamente all'epatite B, nella diagnosi di cui si tiene conto dei marcatori antigenici e anticorpali, con l'epatite C, solo gli anticorpi vengono catturati dall'ELISA, che è associato a una bassa concentrazione di virus nel sangue. Gli antigeni del virus dell'epatite C possono essere rilevati in campioni di biopsia epatica.

La diagnosi di laboratorio comprende tre tipi principali di test.

Marcatori sierologici per epatite C acuta

Rilevazione di anticorpi. Nonostante l'alta specificità, i moderni sistemi immunologici di analisi diagnostica non sono assicurati contro la sovradiagnosi, cioè con risultati positivi al ritardo. Per escluderli è necessaria anche una valutazione basata sui risultati di analisi ottenute a diversi intervalli di tempo. I risultati falsi-negativi sono anche possibili quando gli anticorpi antivirali non possono essere rilevati, nonostante la presenza di un virus nel corpo. Questo succede nei seguenti casi:

- il periodo iniziale della malattia;

- mentre i pazienti assumono immunosoppressori - farmaci che sopprimono il sistema immunitario;

- a infezione con alcuni genotipi (prima di tutto 3 e 4).

Attualmente vengono prodotti sistemi di test commerciali per rilevare gli anticorpi contro il virus dell'epatite C del 1 ° genotipo. Tuttavia, tali test potrebbero non essere sufficientemente efficaci per il rilevamento affidabile di anticorpi quando sono infetti da un virus di un genotipo diverso. Ciò è di grande importanza per le regioni in cui prevalgono altri tipi di virus. Pertanto, per una diagnosi efficace dell'epatite C è necessario un test altamente sensibile in grado di reagire con anticorpi al virus dell'epatite C di qualsiasi genotipo.

Determinazione dell'RNA virale. L'RNA del virus dell'epatite C viene rilevato a scopo diagnostico e, ad oggi, questo test è considerato il "gold standard" nella diagnosi dell'epatite C. Per questo, la versione classica della reazione a catena della polimerasi (PCR) è più ampiamente utilizzata. Con il suo aiuto è possibile monitorare la riproduzione del virus e giudicare la sua presenza nel fegato e in altri tessuti. La definizione di RNA viene spesso utilizzata per confermare il risultato della rilevazione degli anticorpi, effettuando una diagnosi precoce di epatite acuta (l'RNA virale può essere rilevato già 7-21 giorni dopo l'infezione, molto prima della comparsa dei primi anticorpi), per monitorare le donne incinte durante il periodo perinatale di infezione e monitorare l'efficacia della terapia antivirale.

I dati di questi due test si completano a vicenda. Risultati positivi dell'analisi PCR in combinazione con risultati negativi per gli anticorpi antivirali sono caratteristici di alcuni periodi di epatite acuta. Gli indicatori negativi delle analisi PCR sullo sfondo del test degli anticorpi positivi possono essere dovuti alla bassa concentrazione di virus (non rilevabile in PCR) nel sangue. Gli esami del sangue PCR positivi ripetuti riflettono l'attivazione del virus nelle cellule del fegato o altri organi.

Inoltre, la PCR viene utilizzata per rilevare il virus nel tessuto epatico prelevato durante la biopsia. Ciò fornisce informazioni più complete sullo sviluppo del processo infettivo, poiché il virus è in grado di rimanere a lungo negli epatociti senza entrare nel sangue o essere presente in esso a basse concentrazioni. Questo si verifica più spesso nelle prime fasi dell'infezione, ma è anche osservato nell'epatite cronica.

La definizione di proteine ​​(antigeni) del virus dell'epatite C. La principale possibilità di rilevare proteine ​​del virus dell'epatite C è stata stabilita poco dopo la scoperta del virus in uno studio immunofluorescente di tessuti prelevati dal fegato di persone con epatite C cronica infettate da scimpanzé e infette da questo virus.

La determinazione delle proteine ​​virali (antigeni) nel siero a causa del loro basso contenuto non è stata possibile per molto tempo. Solo di recente sono stati sviluppati approcci metodologici per la rilevazione immunofermentale della proteina C interna nel sangue e la produzione dei primi sistemi di test commerciali è stata organizzata. La loro introduzione in pratica consentirà di risolvere questioni controverse della diagnostica su basi più economiche rispetto alla definizione di RNA virale. Determinare i livelli di AlAT è il metodo più economico per valutare l'attività del decorso dell'epatite C. Tuttavia, una volta ottenuti i dati potrebbero non essere sufficienti per determinare la gravità della malattia.

Informazioni più importanti sul danno epatico possono essere date determinando la concentrazione di ALT per diversi mesi. Per ottenere informazioni sull'entità del danno epatico che non è disponibile con altri metodi di ricerca, un medico può dare una biopsia epatica. I dati ottenuti come risultato di questa procedura, consentono di decidere in favore dell'inizio o dell'annullamento del trattamento antivirale.

L'articolo utilizza materiali provenienti da fonti aperte: Autore: Trofimov S. - Libro: "Malattie del fegato"

Diagnosi marcatore dell'epatite B e C acuta e cronica

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Disciplina "Malattie infettive"

DIAGNOSTICA DEL MARKER DELL'EPATITE ACUTA E CRONICA B E C.

Head. Dipartimento: professore.

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Rilevamento di marcatori sierologici di epatite virale.... 3 pagine

Serodiagnosi dell'epatite virale B............................... 4 pagine

Serodiagnosi dell'epatite virale C.....................................10 p

Elenco di letteratura usata................................. 19 pp.

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Rilevazione di marcatori sierologici di epatite virale

È possibile stabilire la natura virale dell'epatite e ottenere informazioni sulla sua eziologia solo identificando i marcatori sierologici dei virus dell'epatite. Tali marcatori includono proteine ​​virali (antigeni), anticorpi specifici prodotti dal corpo in risposta a un'infezione e acidi nucleici del virus (DNA o RNA), che rappresentano il suo genoma. La combinazione di metodi per la rilevazione di specifiche proteine ​​virali o batteriche (antigeni) o anticorpi prodotti nell'ospite in presenza di uno o un altro agente patogeno nei tessuti e nei liquidi biologici viene definita come metodi immunologici di analisi di laboratorio. Negli ultimi decenni, i metodi di ricerca immunologica sono diventati molto diffusi. La ragione di ciò è stata la stretta fusione tra immunologia e biotecnologia, che ha permesso di sviluppare e mettere in pratica una vasta gamma di sistemi di test basati sull'interazione dell'antigene - anticorpo. Per l'epatite virale, l'ELISA si riferisce a metodi indiretti per la rilevazione del patogeno, consentendo di stabilire l'eziologia della malattia. Relativamente recentemente, i metodi di genodiagnostica sono stati introdotti nella pratica dei laboratori di diagnostica clinica, che consentono il rilevamento e la caratterizzazione di geni o sequenze di DNA e / o RNA privi di senso. Il loro sviluppo è dovuto allo sviluppo nel 1983 del principio della reazione a catena della polimerasi (PCR). I primi rapporti sull'applicazione pratica della PCR sono comparsi nel 1985 e da allora il numero di pubblicazioni in cui la PCR è utilizzata come uno dei metodi di ricerca è uno dei primi posti nella letteratura scientifica mondiale. Questi approcci sono applicabili al rilevamento e allo studio dei genomi infettivi

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agenti, rilevamento di marcatori di malattie oncologiche, rilevamento di cambiamenti genetici nel genoma umano associati a determinati disturbi funzionali. Diversamente dall'ELISA, l'analisi PCR si riferisce a metodi diretti di rilevazione del patogeno nel materiale clinico, che consente di valutare l'attività del processo virale e di tracciare i processi di diffusione del patogeno in vari organi e tessuti.

Serodiagnosi dell'epatite virale B.

Il virus dell'epatite B (virus dell'epatite B, HBV) appartiene alla famiglia degli Hepadnoviridae. Il genoma del virus è rappresentato da una molecola di DNA circolare parzialmente raddoppiata di 3200 bp di dimensione. Sotto microscopia ottica, l'HBV si presenta come una particella sferica con un diametro di 42 nm (particella danese) costituita da un nucleo - un nucleoide a forma di icosaedro con un diametro di 28 nm, all'interno del quale vi è un DNA a doppia elica, proteina terminale e enzima DNA polimerasi. La proteina nucleoide contiene HBcAg e HBeAg. Il guscio esterno (7 nm di spessore) è formato dall'antigene di superficie HBV - HBsAg. Il virus dell'epatite B è uno pseudoretrovirus, cioè il suo DNA può essere parzialmente inserito nel genoma degli epatociti.

Con l'AVH e l'esacerbazione dell'epatite cronica, le particelle virali possono essere rilevate negli epatociti e nel siero del paziente. Con la forma integrativa di epatite B cronica e nella fase di remissione, l'HBV nel siero non viene rilevato. La base della diagnosi di laboratorio dell'infezione da HBV è la determinazione dei marcatori sierologici dell'infezione virale: HBsAg, HBeAg, anti-HBc classe IgM e IgG, anti-HBe e anti-HBs, HBV DNA e attività della DNA polimerasi virale. A seconda del decorso dell'epatite B virale, lo spettro dei cambiamenti nei marcatori sierologici appare diverso.

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L'HBsAg è un importante marker dell'infezione da HBV. Nella B virale acuta nella maggior parte dei casi (90-80%) l'HBsAg può essere rilevato nel periodo di incubazione, a partire dalla 3-5a settimana di infezione. La durata media della circolazione dell'antigene è di 70-80 giorni. La rapida scomparsa di HBsAg (nei primi giorni di ittero) con la comparsa di antiBB è un segno prognostico scarso. Nell'epatite B cronica, l'HBsAg può circolare nel sangue del paziente per molti anni. Va notato che i metodi attualmente utilizzati per la determinazione di HBsAg, incluso ELISA, hanno una soglia di sensibilità. Pertanto, in presenza di segni clinici di epatite e assenza di HBsAg nel siero, è necessario indagare su altri marcatori dell'infezione da HBV. La presenza di HBsAg nel sangue indica la presenza di un virus nel fegato ed è molto probabile nel sangue. Non tutti i sieri contenenti HBsAg contengono il virus dell'epatite B. In alcuni casi, il DNA del virus non è completamente integrato nel DNA dell'epatocita, ma parzialmente, solo dalla regione che codifica per la sintesi dell'HBsAg. In questi casi, HBsAg viene sintetizzato senza altri componenti del virione (cioè senza altri antigeni). Si ritiene che questa situazione si verifichi quando il vettore "sano" HBsAg. L'HBeAg del virus dell'epatite B caratterizza l'alta infettività del sangue, essendo un indicatore della replicazione attiva dell'HBV. L'HBeAg circola nel sangue del paziente solo in presenza di HBsAg. Nella prima settimana del periodo itterico, viene rilevato nell'85-95% dei pazienti. Il rilevamento di HBeAg per due mesi o più serve come segno prognostico dello sviluppo dell'epatite cronica. Nella maggior parte dei pazienti con epatite cronica con un'alta attività del processo HBeAg, persiste a lungo (fino a diversi anni). Anticorpi contro l'antigene nucleare della classe di virus dell'epatite B M (anti-HBc IgM) - un marcatore di replicazione attiva di HBV e infezione acuta. Identificato 1-2 settimane dopo la scoperta di HBsAg e persistono per 2-18 mesi. Nel 4-20% dei pazienti con epatite B acuta, l'anti-HBc IgM è l'unico marker di infezione. a

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CG In anti-HBc IgM può essere rilevato in alcuni pazienti con titoli più bassi rispetto a quelli in infezione acuta, con il titolo anticorpale che riflette la gravità dell'epatite. Gli anticorpi anti-HBcAg classe G (anti-HBc IgG) compaiono quasi contemporaneamente con anti-HBc IgM. Di regola, rimangono con tutte le persone che hanno avuto l'epatite B per tutta la vita. L'anti-HBc IgG viene fatto circolare insieme a HBsAg nel 95% dei portatori di HBsAg. Gli anticorpi anti-HBsAg (anti-HBs) indicano una precedente infezione o la presenza di immunità post-vaccinazione (livello protettivo - 10 IU / ml). Compaiono nel periodo di recupero, 4 settimane dopo la scomparsa di HBsAg, raggiungendo una concentrazione massima in 1-2 anni, seguita da una graduale diminuzione del livello inaccessibile per il rilevamento mediante moderni metodi diagnostici. In alcuni casi, gli anti-HB possono circolare a vita. La comparsa di anti-HBs sullo sfondo del miglioramento clinico in un paziente con epatite B è un buon segno prognostico. È importante notare che nella dinamica dell'infezione acuta da HBV c'è una "finestra" quando HBsAg non è più definito e gli anti-HBs non sono ancora apparsi. Allo stesso tempo vengono rilevate IgM e IgG anti-HBc. Ne consegue che è necessario esaminare pazienti con AVH per anti-HBc IgM anche con risultati negativi dello studio HBsAg e anti-HBs. Gli anticorpi anti-HBeAg (anti-HBe) compaiono nel sangue dopo l'eliminazione di HBeAg e il completamento della replicazione virale. Entro la fine della 9a settimana del periodo acuto dell'epatite B, oltre il 90% dei pazienti ha anti-HBe. Durante il periodo di recupero, l'anti-HBe può scomparire. Tuttavia, la presenza di anti-HBe non è un'indicazione dell'assenza di infettività di un particolare siero. È stato dimostrato che in un certo numero di pazienti durante lo sviluppo dell'epatite B (circa il 10%), sotto l'influenza della "pressione immunitaria" sul virus, si formano forme mutanti che "evitano" la sorveglianza immunitaria e non vengono eliminate. Un mutante è stato isolato dai vettori di anti-HBe, incapace di produrre HBeAg a causa di difetti nella regione precore ed è stato designato HBeAg-negativo. L'aspetto di un mutante HBeAg-negativo porta alla progressione del danno epatico quando

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continua replicazione virale (presenza di HBV DNA nel siero). L'infezione primaria con mutante HBeAg-negativo aumenta significativamente il rischio di epatite fulminante. I marcatori dell'epatite B descritti sono esaminati dall'ELISA. Lo spettro di anticorpi (anti-HBe, anti-HBs, anti-HBc IgM, anti-HBc IgG) e antigeni (HBsAg, HBeAg) consente di stabilire la diagnosi di epatite B e determinare lo stadio della malattia (Tabella 3). Lo svantaggio di questo metodo è l'impossibilità del suo utilizzo nell'infezione con forme mutanti del virus, con immunosoppressione (pazienti oncologici, tossicodipendenti, ecc.) E per la valutazione quantitativa del patogeno presente nel corpo. La soluzione di questi problemi è diventata possibile grazie all'introduzione di metodi molecolari-biologici nella pratica dei laboratori diagnostici clinici.

Tabella 3. Varie combinazioni di marcatori sierologici dell'infezione da virus dell'epatite B e loro interpretazione

Diagnosi sierologica dell'epatite virale

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Se non ci sono sufficienti dati clinici ed epidemiologici per presupporre l'eziologia dell'epatite, i seguenti marcatori sierologici sono studiati nella prima fase:

  • HAVAb, IgM (epatite acuta A)
  • HEVAb, IgM (epatite acuta E)
  • HBsAg, HBcAb (epatite B)
  • HCVAb (epatite C)

In caso di reazione positiva all'HBsAg e (o) all'HBcorAb totale, è necessario un ulteriore chiarimento della diagnostica dello stadio del processo di infezione, test:

La prolungata persistenza di HBcorAb, con test negativi di HBsAg e HBsAb, può essere l'unico marker di infezione cronica con un ceppo mutante di epatite B.

Diagnosi di co-infezione o superinfezione con il virus dell'epatite delta:

Per una reazione positiva a HCVAb, sono necessarie ulteriori ricerche:

  • HCVAb, IgM
  • Spettro di proteina HCVAb in ELISA o immunoblot
  • HCV, RNA

Per valutare la prognosi dell'epatite C e la risposta alla terapia con interferone, si consiglia di digitare HCV.

Marcatori diagnostici dell'epatite virale e interpretazione clinica dei risultati

marcatore

definizione

Interpretazione clinica

Marcatori dell'epatite A

Marcatori dell'epatite E

Marcatori dell'epatite B

Marker dell'epatite D (delta)

Marcatori dell'epatite C.

Marcatori dell'epatite G

La quantità raccomandata di esame pre-vaccinazione:
Prima della vaccinazione per il virus dell'epatite B, è necessario condurre uno studio:

L'identificazione di un titolo elevato di anticorpi protettivi: HBsAb indica che l'infezione è già stata trasferita, che esiste un'immunità stabile e che non vi è alcuna necessità di vaccinazione. Le reazioni positive a HBsAg e HBcAb che indicano la presenza di infezione richiedono una decisione individuale sull'adeguatezza dell'introduzione del vaccino.

Fonte: USAID, Ministerul Sanatatii al Republicii Moldova. Diagnosticul de laborator al Hepatitelor virale B, C e D. Instructiuni metodice, 2007

Nel caso di reazioni negative nel rilevamento di marcatori di epatite virale A, B, C e D, si deve escludere l'epatite causata dai virus di Epstein-Barr e dalla citomegalia:

  • CMV, IgG
  • CMV, IgM
  • EBV antigene precoce, IgG
  • Antigene nucleare EBV, IgG
  • VCA EBV (antigene capsico), IgG
  • Virus VCA di Epstein Barr (antigene del capside), IgM

DIAGNOSTICA DEL LABORATORIO DELL'EPATITE VIRALE

A. A. Asratyan Institute of Epidemiology and Microbiology N.F.Hamal e RAMS,
Accademia Medica di Mosca. IMSechenov

Le basi della diagnosi di laboratorio dell'epatite virale sono:

- conoscenza dei loro agenti patogeni e replicazione

- informazioni sull'aspetto e sulla scomparsa dei marker di infezione

- moderni metodi immunochimici e molecolari biologici per la rilevazione di antigeni, anticorpi e acidi nucleici /

Diagnosi di laboratorio dell'epatite B (HB) La struttura del virione, vedi fig. 1.

Diagnosi di laboratorio dell'epatite B - basata sull'identificazione di antigeni specifici per HBs e gli anticorpi corrispondenti nel sangue, così come acidi nucleici virali, i principali dei quali sono:

classe anti-HBs IgM e IgG

NVE Ag - anti-NVE

Il più usato nella diagnosi di HBs è la definizione di HBsAg. Questo antigene è rilevato in entrambe le patologie acute e croniche (tuttavia, l'infezione acuta è solitamente confermata dalla presenza di alti titoli di IgM anti-HBc). Nell'HBV acuto, l'antigene di superficie del virus viene rilevato dopo 3-5 settimane dal momento dell'infezione, cioè molto prima dell'inizio dei segni clinici della malattia e in questi casi è l'unico marker sierologico. L'HBsAg viene costantemente rilevato nei periodi pre-itterico e itterico della malattia. La persistenza di HBsAg per 6 mesi o più indica un decorso prolungato o cronico della malattia e suggerisce uno stato portante cronico del virus. L'eliminazione dell'HBsAg e la comparsa di anticorpi ad esso è una condizione indispensabile per il recupero. I marcatori sierologici della replicazione dell'HBV sono anti-HBs della classe IgM, HBeAg, DNA e DNA polimerasi, che sono rilevati nell'HBV acuta dai primi giorni di manifestazioni cliniche e possono essere rilevati durante l'esacerbazione dell'HBV cronica. I marcatori sierologici della replicazione dell'HBV sono determinati sia per la diagnostica generale che per valutare l'efficacia della terapia utilizzata. L'HBcAg viene rilevato nel tessuto epatico e non viene rilevato nel siero. Mediata dalla sua presenza nel corpo riflette gli anticorpi circolanti - IgM e IgG di classe anti-HBc. Nel periodo acuto di HB, la presenza di IgM di classe anti-HBc è un marker aggiuntivo di questa malattia. Tuttavia, è necessario tenere conto del fatto che circa il 50% dei pazienti con epatite B cronica può anche avere questi anticorpi nel periodo di esacerbazione, ma più spesso a basse concentrazioni. La presenza di solo IgG di classe anti-HBc nel siero è osservata tra la scomparsa di HBsAg e la formazione di anti-HBs. La rilevazione combinata di IgG di classe anti-HBc a basso titolo con anti-HBs indica un'infezione HB trasferita e la presenza di immunità. Il test di HBeAg viene effettuato su sieri di sangue solo con la presenza di HBsAg e il risultato positivo di questo marker indica un processo attivo - conferma la diagnosi di HBV acuta o indica una esacerbazione di HB cronica. La durata della circolazione di HBeAg ha un importante valore prognostico: l'identificazione di HBeAg 2 o più mesi dopo l'insorgenza della malattia indica un possibile sviluppo di epatite cronica. Il rilevamento di HBeAg senza la presenza di HBsAg nel siero nella maggior parte dei casi indica un risultato falso dell'analisi. Tuttavia, i pazienti infetti dal virus mutante possono rimanere sieronegativi per HBeAg, nonostante la persistenza dell'infettività e la presenza di anti-HBe.La presenza di DNA dell'HBV (il marcatore più sensibile della replicazione dell'HBV) nel siero indica un'elevata infettività di questo campione e riproduzione attiva del virus nel corpo. Un risultato positivo può essere registrato in quasi tutti i pazienti con HBV acuta nel bel mezzo della malattia. Ridurre la sua concentrazione nel trattamento dell'epatite cronica è un buon segno prognostico che indica l'efficacia della terapia utilizzata. L'alta attività di siero aminotransferasi riflette il danno infiammatorio al tessuto epatico, causato principalmente dalle reazioni del sistema immunitario dell'organismo contro gli epatociti infettati dal virus e non dall'effetto citopatico diretto del virus. Un alto livello di DNA dell'HBV in combinazione con un basso livello di aminotransferasi indica una risposta immunitaria insufficiente dell'organismo. La rilevazione di anti-HBe in assenza di HBeAg e HBV DNA indica che la replicazione attiva dell'infezione è terminata. La sieroconversione di HBsAg in anti-HBs si verifica nel 90-95% dei pazienti con HB acuta allo stadio di risoluzione del processo infettivo ed è un indicatore di immunità al virus HBV, cioè la presenza di anti-HBs indica un'infezione e la presenza di immunità a questa infezione. Le persone che hanno questi anticorpi in una concentrazione protettiva (10 UI o più) non soffrono di HS e non hanno bisogno di essere vaccinati. Tutti i metodi di ricerca applicata per la determinazione di specifici marcatori di HB possono essere suddivisi in 2 gruppi: immunochimico e biologico molecolare. Immunochimico - il posto principale appartiene al saggio di immunoassorbimento legato all'enzima (ELISA) con la sua alta sensibilità e specificità, facilità di implementazione e stabilità dei reagenti. Biologia molecolare - l'ibridazione di punti e liquidi, così come la reazione di polimerasi a catena (PCR) - consente di rilevare la presenza di DNA di HBV, determinando l'enzima virus specifico - DNA polimerasi. HB sAg / anti-HB s Per identificare il marcatore principale dell'HBV, sono stati sviluppati vari metodi per determinare l'antigene a concentrazioni fino a 0,05 ng / ml, che sono suddivisi in cosiddette "generazioni" (Tabella 1). Attualmente, il metodo principale per rilevare HBsAg è ELISA Un passo importante nello sviluppo della diagnosi di laboratorio dell'epatite virale in Russia è stata la condotta (dal 1998) dei test comparativi dei prodotti diagnostici per valutarne la qualità sotto gli auspici del Ministero della Sanità della Federazione Russa. I moderni prodotti diagnostici hanno un'elevata specificità, ma sono possibili risultati falsi positivi. Per distinguere i falsi positivi da risultati veramente positivi, viene utilizzato un test di neutralizzazione di HBsAg, un siero specifico. Fondamentalmente nuovo per il sistema di rilevamento HBsAg era il requisito per i produttori nazionali di farmaci diagnostici - l'inclusione obbligatoria nel sistema di test di un campione di controllo debolmente positivo contenente HBsAg ad una concentrazione di 1 ng / ml. Per determinare l'anti-HBsAg, è stato testato l'intero spettro dei metodi immunochimici, il principale dei quali è ora ELISA (per analisi qualitative e quantitative). Classe anti-HBc IgM e IgG, HBe Ag - anti-HBe (Fig. 2 e Tabella 2) Per testare questi marcatori possono essere utilizzati vari tipi di immunodosaggio in fase solida: immunoenzimatico, radioimmunoassay, chemiluminescente e le loro varie varianti. Il DNA dell'HBV viene determinato mediante analisi PCR. Attualmente, i più diffusi metodi di amplificazione per la rilevazione del DNA dell'HBV. Ora è possibile determinare il DNA dell'HBV in forma qualitativa e quantitativa.

Diagnosi di laboratorio dell'epatite D (DG) Il virus dell'epatite D (IOP) è un virus difettoso contenente un RNA a singola elica che necessita dell'aiuto del virus HBV per la replicazione per sintetizzare le proteine ​​dell'involucro costituito da HBsAg, che viene utilizzato per incapsulare il genoma della PIO. La IOP non appartiene a nessuna delle famiglie note di virus animali, con le sue proprietà IOP più vicine ai viroidi e ai virus satellitari delle piante. La diagnosi di laboratorio viene effettuata rilevando marker sierologici di IOP, inclusa la presenza di antigene, anticorpi ad esso e RNA di IOP. L'individuazione dell'antigene IOP e dell'IOR RNA nel siero o nel tessuto epatico indica la presenza di infezione HG attiva, tuttavia, è necessario notare che questi marker potrebbero non essere rilevati nel siero dei pazienti con HD fulminante. Il marcatore per la replica IOP attiva è anche IgM di classe IOP anti-IOP. I marcatori sierologici dell'infezione HD dipendono da come è stato acquisito il virus - nella forma di coinfezione con HBV (nella maggior parte dei pazienti, la malattia ha un decorso acuto e termina in recupero) o una superinfezione in pazienti con infezione cronica da HBV (è più difficile della coinfezione - il 10% sviluppa epatite fulminante). Nella maggior parte dei casi, gli anticorpi - IgM e IgG di classe IOP anti-IOP vengono rilevati durante il decorso della malattia. Il titolo anti-IOP viene solitamente ridotto a livelli virtualmente non rilevabili dopo il recupero e non rimangono marcatori sierologici che una persona sia mai stata infettata con IOP. L'antigene della PIO viene rilevato solo nel 25% dei pazienti e di solito scompare con la scomparsa di HBsAg. Se superinfettato in pazienti con infezione cronica da HBV, il quadro sierologico ha le seguenti caratteristiche: - il titolo HBsAg è ridotto nel momento in cui l'antigene della PIO appare nel siero; - L'antigene della PIO e l'RNA-IOP continuano a essere rilevati nel siero, come di solito nella maggior parte dei pazienti si sviluppa un'infezione cronica da superinfezione da HG (70-80%), a differenza dei casi di coinfezione; - Determinati titoli anticorpali elevati (anti-IOP) sia della classe IgM sia di IgG, che persistono indefinitamente. Marcatori sierologici del virus DG determinati mediante analisi immunoenzimatica e analisi radioimmunologica e RNA-IOP - mediante il metodo della reazione a catena della polimerasi. Le imprese biotecnologiche industriali nazionali ed estere producono kit diagnostici, inclusi tutti i componenti e i reagenti necessari per il test. Nei preparati diagnostici viene utilizzato un antigene delta derivato dal fegato di marmotta sperimentalmente infetto da HD; antigene isolato dal fegato di portatori morti di IOP; Antigene delta, ottenuto con metodo di ingegneria genetica.

Diagnosi di laboratorio dell'epatite C (HS) La scoperta dell'agente causativo dell'HS è diventata possibile grazie ai metodi della biologia molecolare nel 1989-1991. In primo luogo, il genoma virale è stato ottenuto clonando dal siero di pazienti con epatite "ni-A, ni-B", e quindi è stata stabilita la struttura del virus stesso. La caratterizzazione fisico-chimica del virus ha permesso di classificare l'HCV come una famiglia di flavovirus. Il genoma del virus HS (HCV) è rappresentato da RNA positivo a singolo filamento, costituito da 10.000 basi nucleotidiche, che formano regioni che codificano tre proteine ​​strutturali (C, E1, E2) e cinque non strutturali (NS2, NS3, NS4, NS5). Una caratteristica dell'HCV è l'estrema eterogeneità del suo genoma. L'analisi degli acidi nucleici di RNA-HCV di vari isolati ha rivelato differenze significative nella loro struttura primaria. Sulla base di questi dati, è stata costruita una classificazione di HCV, dividendoli in varianti (6-9) e sottotipi-genotipi, alcuni dei quali sono presenti in tutte le regioni del mondo, e altri solo in singoli paesi. La diagnostica di laboratorio dell'HS è stata risolta usando moderni metodi di biologia molecolare, dato che quando il virus HS è a concentrazioni estremamente basse e i suoi antigeni non sono disponibili per il rilevamento usando moderni metodi di indicazione, gli sforzi dei ricercatori sono focalizzati sulla rilevazione di anticorpi a vari componenti antigenici del virus, il cui rilevamento può Indica la presenza di un virus. Gli antigeni utilizzati erano proteine ​​codificate dalla zona strutturale e non strutturale dell'RNA-HCV, ottenute utilizzando la tecnologia o la sintesi ricombinante (i polipeptidi utilizzati nei moderni metodi immunologici sono C22-3, C33c, C100-3, C200, NS5, S-1-1 ). La diagnosi di laboratorio di HS si basa sulla rilevazione di marcatori sierologici di HCV: anticorpi al virus HS (anti-HCV, anti-HCV IgM, IgG) mediante ELISA e RNA-HCV mediante PCR. Ad oggi, sono state sviluppate 4 generazioni di sistemi di test per rilevare l'anti-HCV nel metodo ELISA, ma l'ELISA di prima generazione non è attualmente utilizzato a causa della sua bassa sensibilità. L'RNA-HCV è un indicatore di replicazione attiva dell'HCV e il primo marker di infezione e può essere rilevato dalla reazione a catena della polimerasi già 1-2 settimane dopo l'infezione, poco prima dell'aumento dei livelli sierici delle transaminasi. L'anti-HCV è rilevato da 5-6 settimane dopo l'insorgenza dell'epatite nell'80% dei casi e dalla 12a settimana nel 90% delle persone che usano il dosaggio immunoenzimatico. Nel determinare l'anti-HCV, in alcuni casi viene registrata una reazione falso-positiva. Per distinguere i campioni falsi positivi da campioni che contengono anticorpi all'HCV, sono stati sviluppati ulteriori test - immunoblotting ricombinante, determinazione dello spettro delle proteine ​​anti-HCV. I test diagnostici di immunoblotting consentono di escludere risultati non specifici ottenuti con l'ELISA, tuttavia, una valutazione visiva delle bande di immunoblotting può essere ambigua in diversi centri diagnostici. Nel nostro paese, i sistemi di test immunoenzimatici di conferma enzimatici domestici (i cosiddetti sistemi Spektr), che sono basati sulla rilevazione di anticorpi contro specifici antigeni virali: core, NS3, NS4ab, NS5a, sono diventati più diffusi. Il rilevamento dell'HCV RNA è considerato lo standard "d'oro" nella diagnosi di HS e la conferma di risultati positivi del rilevamento anti-HCV. Attualmente, PCR in forma qualitativa e quantitativa viene utilizzato per indicare HCV RNA. La sensibilità dei metodi per determinare l'RNA dell'HCV aumenta ogni anno, raggiungendo attualmente 10-50 copie di RNA in 1 ml di sangue. La diagnosi di HS cronica in individui con anti-HCV viene solitamente effettuata sulla base di test epatici elevati per più di 6 mesi.

Diagnostica di laboratorio dell'epatite A (HA) Il virus HA (Fig. 3) è un virus a 27 nm contenente RNA, classificato come picornavirus. In tutti gli isolati raccolti in diverse parti del mondo, esiste un solo sierotipo di HAV. L'HAV non ha guscio esterno, ma consiste in una capsula proteica esterna, o capside, contenente un RNA positivo a singolo filamento all'interno, che funge da modello per la produzione di proteine ​​virali all'interno della cellula ospite. La diagnosi di laboratorio di HA si basa sulla rilevazione di marcatori del virus HA - antigene HAV, anticorpi (anti-HAV IgM e IgG), nonché HAV RNA. La prova finale di un'infezione corrente o recente è la presenza nel siero (anche in un campione di siero) di anticorpi contro IgM di classe IgA (anti-HAV IgM) e la presenza di HAV nelle feci. La presenza di anticorpi contro l'HA e un'immunità di lunga durata è indicata dalla presenza di anticorpi anti-HAV IgG (anti-HAV IgG). La diagnosi di HA acuta è confermata in uno stadio acuto o precoce di recupero in presenza di una classe IgM anti-HAV, che compare negli ultimi 5-10 giorni del periodo di incubazione e continua a essere rilevata per 6-7 mesi dall'esordio della malattia. Inoltre, questi anticorpi possono essere rilevati nei primi mesi in individui (20-30%) vaccinati con vaccino HA inattivato. La loro formazione è associata alla risposta immunitaria primaria all'introduzione dell'antigene e non all'infezione causata dal vaccino. L'RNA di HAV può essere rilevato diversi giorni prima dell'aumento dell'attività dell'ALT e entro 5-59 giorni di malattia con un ciclo tipico di HA; in casi prolungati, l'RNA di HAV può essere misurato in media fino a 95 giorni. L'antigene del virus HA (HAV-Ag) si trova nelle feci dei pazienti 7-10 giorni prima dell'inizio dei sintomi clinici e nei primi giorni della malattia, che viene utilizzato anche per la diagnosi precoce e l'identificazione delle fonti dell'agente infettivo. La concentrazione di HAV nelle feci è la più alta per 2 settimane. prima della comparsa di ittero. Negli adulti, l'escrezione del virus con le feci di solito dura meno di una settimana dopo la comparsa di ittero. Il virus, tuttavia, è stato rilevato anche dopo 2 mesi. dall'esordio della malattia (durante l'esacerbazione). I bambini possono secernere il virus più a lungo degli adulti, possibilmente entro poche settimane dopo la manifestazione clinica della malattia. Lo scarico cronico di HAV da feci non è osservato. La definizione dell'antigene HAV ha anche trovato applicazione nella virologia sanitaria nello studio dell'acqua per la presenza di un virus. IgG di classe anti-HAV (Fig. 4) compare anche all'inizio della malattia (da 3-4 settimane), persiste per tutta la vita e fornisce una protezione permanente contro questa malattia. La definizione di IgG anti-HAV è utilizzata per studiare la struttura immunologica della popolazione e le dinamiche dell'immunità umorale specifica. La determinazione della classe IgG anti-HAV è importante anche per lo screening pre- e post-vaccinazione (la concentrazione protettiva minima di anti-HAV corrisponde a 20 UI / l). Per la loro determinazione, i produttori nazionali producono preparati immunoenzimatici diagnostici commerciali. La diagnostica di laboratorio si basa sulla rilevazione di marcatori del virus HA mediante metodi immunodiagnostici specifici - metodi ELISA e RIA. Le imprese biotecnologiche industriali nazionali ed estere producono kit diagnostici, inclusi tutti i componenti e i reagenti necessari per il test. Oltre a ELISA in fase solida e RIA, vengono utilizzati con successo anche il metodo della microscopia immunoelettronica e il metodo della PCR. Tutti i metodi sopra menzionati di immunodiagnostica con uguale probabilità rivelano forme inapparenti, non sintomatiche o clinicamente pronunciate di HA. Un posto speciale nella diagnosi di laboratorio di GA è occupato da metodi di test genetici molecolari per l'RNA di HAV. La diagnostica PCR è in grado di rilevare l'RNA di HAV a una concentrazione di 40 copie / ml. Attualmente, vi è un accumulo di dati sul luogo della PCR nel sistema di diagnosi di laboratorio di GA.

Diagnosi di laboratorio dell'epatite E (HEU) L'agente eziologico dell'epatite E (HE) è un virus sferico privo del guscio esterno, è un virus a RNA a filamento singolo di circa 32-34 nm di diametro. Quando si effettua una diagnosi di HE in ogni singolo caso, devono essere presi in considerazione diversi argomenti diagnostici: - il paziente ha un sintomo complesso di epatite acuta e presumibilmente contagiosa, - un'eccezione affidabile alla partecipazione eziologica dei virus dell'HA e dell'HBV, sulla base di test sierologici negativi - classe IgM anti-HAV e anti-HBs della classe IgM - un'accurata analisi dei dati della storia epidemiologica, comprese le indicazioni delle recenti visite in regioni endemiche, - uno studio (se possibile) di ferite alle feci la presenza di particelle virali da immunoelettronica microscopio CGU, PCR. Esistono metodi diagnostici basati sull'uso di anticorpi immunofluorescenti (MFA) per la determinazione dell'antigene HEV nelle feci e sul saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione degli anticorpi contro HEV - anti-HEV di IgM e IgG. La presenza di IgM anti-HEV classe con alta frequenza è determinata nei sieri di pazienti con CU nella fase acuta della malattia e nel periodo di recupero precoce; l'identificazione della classe IgG anti-HEV indica una precedente infezione da HU. Per la diagnosi di GE, viene determinato anche l'HEV RNA. Produttori nazionali di sistemi di test diagnostici per il rilevamento di marcatori di epatite virale:

MOSCA e la regione - NEARMEDIC - ECOlab - BIOSERVICE

NOVOSIBIRSK - VECTOR BEST - VECTOR MBS (MEDICOBIOL.SOYUZ) - VETTORE A BIALGAM

NOVGOROD INFERIORE - MICROGENO (precedentemente IMBIO) - SISTEMI DIAGNOSTICI SAN PIETROBURGO - AVICENNA - AQUAPAST


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